發布時間：2024-02-21 14:41:57
序言：寫作是分享個人見解和探索未知領域的橋梁，我們為您精選了8篇的基因多態性研究樣本，期待這些樣本能夠為您提供豐富的參考和啟發，請盡情閱讀。
[中圖分類號] R631 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）25-22-03
Study of Toll-like Receptor Gene Polymorphism in Sepsis
WANG Zhiyi SUN Laifang
Department of Emergency，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，China
[Abstract] Sepsis is defined as the systemic inflammatory response of the body to an infection. Numerous studies show that the susceptibility and clinical outcome of sepsis associated with the different genetic background. This review summarizes the research on relationship between the sepsis and Toll-like receptor gene polymorphisms.
[Key words] Toll-like receptors；Gene polymorphisms；Sepsis
膿毒癥是感染引起的全身性炎癥反應綜合征，是創傷、燒傷、術后感染和危重病的常見并發癥，可進一步發展成嚴重膿毒血癥、膿毒性休克和器官功能障礙綜合征，甚至死亡。流行病學調查顯示[1]，膿毒癥的發病率和死亡率隨年齡的增長而增加，且黑人膿毒癥易感性比白人高，死亡率也明顯高于其他人種，可見機體的遺傳因素對膿毒癥的易感性和臨床轉歸具有重要的作用。為進一步證實遺傳因素對膿毒癥的作用，2001年國際膿毒癥定義會議建議將遺傳背景因素作為膿毒癥病因的重要組成部分進行研究。近年來，國內外對膿毒癥的基礎與臨床研究十分重視，大量研究表明Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）與膿毒癥的發病機制有關[2]。本文就膿毒癥與TLRs基因多態性研究作如下綜述。
1Toll樣受體
TLRs是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質分子。1980年，Nusslein-Volhard等在研究果蠅胚胎發育過程中發現一個決定果蠅的背腹側分化的基因，將其命名為Toll基因。目前，在人類中已經發現的TLRs家族成員有11個，根據染色體的位置、基因結構和氨基酸序列，可分為5個亞科，即TLR2（包括TLR1、TLR2、TLR6和TLR10）、TLR3、TLR4、TLR5和TLR9（包括TLR7、TLR8和TLR9）。TLRs結構包括胞外富含亮氨酸的重復序列（LRR），跨膜區，胞內Toll/IL-1受體結構域。TLRs介導的信號途徑包括激活NF-κB、MAP激酶、干擾素調節因子（interferon regulatory factors，IRFs），從而釋放細胞因子、化學增活素、干擾素與免疫球蛋白，在宿主防御免疫反應方面起著重要作用。1997年，Medzhitov等報道了與果蠅同源性的人類Toll，當其過多表達時可活化NF-κB，并誘發刺激分子表達[3]。
2TLRs基因多態性與膿毒癥
基因多態性是指在一個遺傳座位上具有一個以上的等位基因，且各個等位基因在群體中的出現頻率皆高于1％，是人體對疾病易感性與耐受性、臨床表型多樣性及藥物治療反應差異性的重要因素。研究發現TLRs、腫瘤壞死因子TNF等炎癥因子、絲裂原活化抑制因子（PAI-1）、人白細胞抗原（HLA）和熱休克蛋白（HSP-70）等基因多態性均與膿毒癥有關。目前，研究較多的是TLRs基因多態性。
2.1 TLR4基因多態性與膿毒癥
Poltorak等[4]和Qureshi等[5]用遺傳學方法發現，攜帶C3H/HeJ和C57BL/lOScCr基因的兩株小鼠表現為對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）高度耐受性和對革蘭陰性菌感染高度易感性。前者為TLR4基因第3外顯子的錯義突變致TLR4基因編碼產物多肽鏈第712位上的脯氨酸被組氨酸所取代，后者為TLR4基因存在無義突變。這種基因突變或多態性解釋了同種個體間對膿毒癥易感性的差異和不同種屬對部分脂多糖結構反應不同，表明TLR4基因是調節LPS反應的關鍵。單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）研究是最常見的基因組學研究方法。目前對TLR4的SNP研究主要集中在Asp299Gly（299位天門冬氨酸與甘氨酸的置換）和Try399Ile（399位蘇氨酸與異亮氨酸的置換）2個位點的突變。Arbour等[6]通過轉染Th.1細胞發現Asp299Gly位點的突變可干擾TLR4介導的LPS信號轉導通路，降低呼吸道上皮細胞對人LPS的刺激反應性。Agnese等[7]研究表明Asp299Gly/Thr399Ile突變可是使革蘭氏陰性菌感染發生率明顯升高。Lorenz等[8]發現單純Asp299Gly多態性只存在于感染性休克患者中，且有等位基因TLR4 Asp299Gly/Thr399Ile的患者易發生革蘭陰性菌感染。Barber RC等[9]研究發現，燒傷患者TLR4的Asp299Gly突變可增加其發生嚴重膿毒癥的危險性。Shalhub等[10]認為TLR4基因的突變與創傷后膿毒癥的嚴重性相關，并認為這種相關性可能不僅是由Asp299Gly單核甘酸多態性引起的，也可能與TLR4其他位點的突變協同導致。
以上研究表明TLR4基因多態性與膿毒癥的發生、發展有密切關系，但也有不少研究得出陰性結果。Jessen等[11]研究顯示，TLR4的基因多態性與革蘭氏陰性菌引起的膿毒癥無明顯相關性。Feterowski等[12]對多種微生物感染引起的術后膿毒癥進行研究，結果顯示膿毒癥的發生率及死亡率與TLR4位點的突變無相關性。Kumpf[13]，Taudoff[14]等認為Asp299Gly與Thr399Ile的突變與膿毒癥細胞因子的變化無明顯相關性。國內學者也有類似報道[15]，單小鷗等[16]研究發現TLR4基因（Asp299Giy、Thr399Ile）多態性與溫州地區漢族兒童膿毒癥易感性無明顯相關性。因此，TLR4基因多態性與膿毒癥相關性及參與因素的影響仍有待進一步研究。
2.2TLR2基因多態性與膿毒癥
TLR2是TLRs家族中的主要成員之一，是宿主防御細菌、真菌及病毒感染的識別受體。目前已發現TLT-2基因存在兩種多態性：Arg753Gln（TLR-2-Ⅰ）和Arg677Trp（TLR-2-Ⅱ）。前者與膿毒癥的發生有關，后者與瘤型麻風的發生有關[17]。研究表明，TLR2基因敲除小鼠對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的易感性明顯增強，對螺旋體的易感性也較野生型的高[18]。Lorenz等[19]對91例膿毒癥休克患者進行TLR2基因分析，發現2例患者具有Arg753Gln多態性，且都伴有金黃色葡萄球菌感染。Thuong等[20]對358名越南結核患者研究發現，TLR2基因多態性與肺結核和結核性腦膜炎的易感性有關。以上研究表明，TLR2基因的變異可能增強機體對致死性細菌的易感性。而Moore CE等[21]對420例金黃色葡萄球菌感染患者進行研究，結果顯示TLR2的Ar9753Gln基因多態性與機體對金黃色葡萄球菌的易感性和嚴重程度不相關。宋振舉等[22]研究也顯示，TLR2基因多態性與中國漢族人群的重癥社區獲得性肺炎易感性和預后無明顯相關性。因此，TLR2基因多態性與膿毒癥的確切關系尚需進一步的研究證實。
2.3TLR5基因多態性與膿毒癥
TLR5在細菌鞭毛誘導的炎性反應中起核心作用。Lissauer等[23]研究表明，膿毒癥患者TLR5的表達較正常人群顯著增高。TLR5基因內存在3個頻率較高的編碼性單核苷酸多態性位點。其中兩個錯義多態性位點592N（rs2072493）和L616F（rs5744174）位于TLR5的胞外區，為引起氨基酸發生改變的SNP位點。另一個多態性位點R392X（rs5744168）是無義突變，可引起11LR5的跨膜結構域和胞內部分的完全缺失，該位點與發生軍團菌引起的肺炎的高風險相關[24]。以上研究表明LR5很可能是膿毒血癥的易感基因，其遺傳學變異可能會影響TLR5的功能。而王志富等[25]對中國255例膿毒癥患者和260例對照個體的3個cSNP（rs5744168，ra5744174和rs2072493）進行研究，結果顯示以上3個導致氨基酸發生改變的SNP位點與膿毒血癥的易感性和嚴重程度無顯著關聯，但不排除其它未進行研究的TLR5基因多態性可能會影響膿毒血癥的發生、發展和轉歸。
2.4Toll樣受體基因多態性的種族差異對膿毒癥的影響
在TLRs基因多態性與炎性應答損傷的遺傳易感性研究中，不同種族及地區的研究結果往往不同。通過對比中國漢族與其他種族TLR4基因的Asp299GIy、Thr399Ile和TLR2基因的Ar9753Glu、Ar9677Trp多態性分布，發現不同種族及地區人群的等位基因頻率及基因型頻率的分布有差異。呂欣等[26]檢測了健康漢族人群及缺血性卒中患者DNA樣本，未發現Asp299Gly和Thr399Ile基因多態性。Hang等[27]也認為TLR4基因編碼區Asp299Gly和Thr399Ile基因多態性在中國人群中非常罕見。其他類似研究也表明中國浙江漢族人[28]、中國湖北漢族人[29]與日本人的等位基因頻率及基因型頻率相似，均未檢測到TLR4基因Asp299Gly、TLR2基因Ar9753Glu和Ar9677Trp的突變位點，而德國人TLR4基因的Asp299Gly突變頻率5.6％、Ar9753Glu突變頻率9.4％，西班牙人Ar9753Glu突變頻率1％[30]，突尼斯人Ar9677Trp為31％[31]。lorenz等[8]、Agnese DM等[32]、Read等[33]分別調查了73例美國人、39例美國人、879例英國人和80例蘇格蘭人（均為健康白種人），發現Asp299Gly攜帶者的比例分別為13％，11％，10.5％，10％。據Smirnoval等[34]統計，歐洲人種多為Asp299Gly/Thr399Ile單倍型，Asp299Gly單倍型在非洲人中出現頻率更高，在亞洲人中這2種突變均極為罕見，也證實了大部分研究中出現這2處基因突變的人群都為白種人或非洲人。
3結語
盡管有大量研究表明Toll樣受體基因多態性與膿毒癥的發生、發展有關，但仍需進一步研究證實。通過不同遺傳背景人群的研究，可以初步推測我國漢族人群中TLR4基因多態性Asp299Gly攜帶者的比例較西方白種人低。TLRs基因多態性的種族差異研究使我們認識到遺傳背景的不同可能會影響其基因多態性在感染性疾病發病中的作用。為膿毒血癥臨床診療提供新的思路、方法和途徑。
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【關鍵詞】腫瘤壞死因子;相關凋亡配體（FAS-670）; 基因多態性;胃癌
【中圖分類號】R735.2【文獻標識碼】A【文章編號】1008-6455（2011）04-0134-02
細胞凋亡是一種基本的生物現象，并參與了各種生理功能，如在機體發育過程中或在某些病理過程，包括免疫系統疾病和腫瘤的發展，調節細胞數量和消除的有害或有潛在危險的細胞。FasL 系統在許多類型的細胞凋亡信號傳導過程中扮演了重要角色。 Fas抗原是一個45 kDa的細胞表面蛋白，屬于死亡受體家族的腫瘤壞死因子/神經生長因子受體超家族。結合的Fas配體（ FasL ）的Fas抗原啟動死亡信號級聯反應，從而導致細胞凋亡。 Fas受體廣泛表達在各種組織細胞上，但FasL表達僅限于細胞內的免疫系統，如激活T細胞和自然殺傷細胞，或免疫特異細胞，如眼睛和繁殖器官[1]。許多腫瘤細胞都已經被證明有Fas和FasL表達的改變。迄今為止，一些研究表明在許多人類惡性實體腫瘤，包括食管癌[2]和乳腺癌中，Fas出現下調。班尼特等人曾[3]報道了胃癌中存在FasL上調和腫瘤浸潤淋巴細胞（淋巴細胞）凋亡。其他的一些研究也表明在人胃癌細胞腺瘤和癌能檢測到許多凋亡細胞，及出現胃癌組織FasL上調，從而逃避宿主免疫攻擊[4]。Fas基因已被確定位于染色體10q24.1區域，而FasL基因位于染色體1q23，兩個潛在功能多態性（即白細胞介素-1B-511T和IL-1RN第2/2）被認為與幽門螺旋桿菌感染與IL-1β的表達有關，由此可能增加了發生各腫瘤的風險。但研究胃癌患者和其Fas FasL基因多態性的之間關系還未見報道。
1 材料與方法
1.1 研究對象
（1）胃癌組 171例胃癌患者來自2001年12月～2005年12月武漢大學中南醫院門診和住院患者，所有病例均經我院組織病理學證實為胃腺癌，采樣前未進行過化療或放療。其中男72例，女63例；平均年齡61.00±1. 64歲（24～84歲）。
（2）正常對照組 收集同期武漢大學中南醫院健康體檢者152例，其中男92例，女60例；平均年齡50.03±1.47歲（21～77歲），均為無血緣關系的湖北漢族人，既往無消化道癥狀、無糖尿病、系統性紅斑狼瘡、關節炎及炎癥性腸病等病史。
1.2 方法
（1）DNA提?。喝?ml抗凝血，用蛋白酶K（Merck公司）消化，酚/氯仿法提取基因組DNA。
（2）Fas-670基因PCR擴增：Fas-670基因片段PCR引物根據文獻設計，由北京三博遠志生物工程技術有限公司合成，順式5’-CTACCTAAGAGCTATCTACCGTTC-3’；反式5’-GGCTGTCCATGTTGTGGCTGC-3’。PCR反應體系總體積25l，含滅菌雙蒸水18.51，10×PCR反應緩沖液2.5l，每側引物各10pmol， dNTPs（Clontech公司）10mmol/L 0.5l，TaqDNA聚合酶（Biostar公司）2U，DNA模板11（約40～100ng）。反應條件：94℃預變性4分鐘，接著30個循環，94℃變性30秒，56℃復性30秒，72℃延伸30秒，72℃終末循環5分鐘，最后置于4℃終止反應。
（3）限制性內切酶消化PCR擴增產物：取10l PCR產物，用限制性內切酶Mva I（MBI公司）0.5l（10U/l）于37℃消化酶切過夜，于65°C滅活20分鐘。
（4）PCR產物鑒定：對消化后的PCR產物片段采用2%瓊脂糖凝膠電泳電泳（100V，1.5小時）分離，溴化乙錠染色分析基因型。
233+99G
A（233+99bp）
G（189+99+44bp）
4 結果
4.1 Fas-670點多態性酶切結果:Fas-670基因626位點電泳酶切結果見圖1?；蛐虲/C純合子酶切片段為189、99、44bp三條帶, G/G純合子為233和99bp二條帶, C/G雜合子酶切片段為189、99、44bp和233bp四條帶。
4.2 Fas-670基因型Hardy-Weinberg平衡檢驗:經χ2檢驗, 胃癌組和正常對照組人群Fas-670基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。（胃癌組χ25.630, P>0.05; 正常對照組χ23.449,P>0.05）。
4.3 胃癌患者Fas-670位點基因多態性分析:如表1所示，與正常對照組比較，胃癌患者組FAS-670位點C/G+G/G基因型頻率略低（62.9% vs 67.5%；Fisher exactp0.4667; OR1.219; 95% CI0.7582-1.662）；并且，慢性胃炎組的FAS-670位點C/G+G/G基因型頻率與正常對照組比較也略低（66.2% vs 67.5%；Fisher exactp0.8809;odds ratio1.058; 95% CI0.5880-1.905）；胃十二指腸潰瘍組的FAS-670位點C/G+G/G基因型頻率與正常對照組比較也略高（69.6% vs 67.5%；Fisher exactp0.8783; odds ratio1.058; 95% CI0.588-1.905）。
表1示，在FAS-670位點，胃癌組C、G等位基因頻率與正常對照組無明顯差異（p0.4262;odds ratio1.115; 95% CI0.8369-1.595）。
表1 胃癌、慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍及正常對照組FAS-670-626基因多態性分布
5 討論
M acFarlane等報道,FAS-670基因（death receptor 4 gene , FAS-670）626等位基因與胃癌發生危險性無關,日本Frank B[1]的研究并也支持上述結果。本研究選擇武漢地區正常人作為對照, 對武漢地區FAS-670基因多態性和胃癌的關系進行研究。本研究結果支持Frank B 和Mac Farlane等的研究結果,這說明攜帶FAS-670的626等位基因與增加武漢地區胃癌發病的危險性無關。我們對FAS-670基因多態性的研究結果與國外的研究比較發現, 武漢地區人群FAS-670的 等位基因頻率與歐洲等國家相似。雖然本研究發現胃癌組和正常組之間宿主基因因素FAS-670的等位基因的分布不存在差異,但這并不能排除這些等位基因可能增加胃癌發病風險的可能。
在本次研究中沒有發現武漢正常人群中FAS-670位點多態性與胃癌之間有相關性，我們分析原因有如下可能樣本選取的偏倚，我們選取的為武漢市漢族人，為一個地區的一個民族，所以可能出現了假陰性結果，所以我們可以在以后進一步擴大樣本含量包括不同民族進行研究；也可能是由于胃癌的發生在不同國家、地區、種族間都存在著明顯差異，胃癌的發生機制可能不同?？傊赴┦且活惍愘|性很高、變化復雜的惡性綜合征，但是胃癌細胞的主要特征是基因組不穩定性，基因組不穩定性可發生在不同水平,從單核甘酸、微衛星、基因、染色體結構性成分直至整條染色體。我們目前的研究發現FAS-670G/C基因型與武漢地區胃癌發生的風險無關，為了確定胃癌的易感基因我們還需要在不同對象中進行進一步的研究。
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目的 探討老年缺血性腦卒中與內皮細胞型一氧化氮合酶（eNOS）基因變數串聯重復序列（VNTR）多態性的關系。方法 選擇老年缺血性腦卒中患者112例作為病例組，同期選擇年齡與性別相匹配的健康志愿者或其他住院患者105例作為對照，通過PCR技術和聚丙烯酰胺電泳來確定其基因型。結果 病例組eNOS基因ab基因型的頻率明顯高于對照組(22.3% vs 12.4%，P＜0.05)，a等位基因的頻率也高于對照組（12.9% vs 7.0% ，P＜0.05）。結論 ab基因型與老年缺血性腦卒中有相關性，a等位基因可能是中國老年缺血性腦卒中的獨立危險因素。
【關鍵詞】 一氧化氮合酶；基因多態性；VNTR；老年；缺血性腦卒中
血管內皮細胞一氧化氮合酶（NOS）編碼基因存在多種基因多態性。其中，第4號內含子27個堿基的變數串聯重復序列（VNTR）多態性與血漿一氧化氮（NO）水平密切相關，該多態性與心腦血管病的相關性研究較多，但結論并不一致。Matyar等〔1〕研究發現內皮細胞型NOS(eNOS)4a/b基因多態性是南部土耳其人冠心病的獨立危險因素，而Vasilakou等〔2〕發現在希臘人中該基因多態性與早發的冠心病沒有相關性。本研究的目的是探討eNOS基因VNTR多態性與中國老年缺血性腦卒中的關系。
1 對象與方法
1.1 研究對象
1.1.1 入選標準
選擇2002年7～12月在青島大學醫學院附屬醫院住院的112例老年缺血性腦卒中患者作為病例組，其中36例短暫性腦缺血發作(TIA)，76例腦梗死，均行頭顱MRI和/或CT掃描明確診斷，符合1996年第四屆全國腦血管病會議修訂的診斷標準，并排除腦出血和占位性病變。選取同期住院的其他疾病患者和健康志愿者105例作為對照。對照組均無腦卒中或冠心病病史。病例組平均年齡(64.9±11.2)歲，男62例；對照組平均年齡(63.9±11.9)歲，男53例，兩組的年齡與性別相匹配，入選對象均行血糖、血脂等檢查。
1.1.2 診斷標準
高血壓的診斷標準為血壓≥140/90 mmHg或正服用降壓藥物；糖尿病的標準為空腹血糖≥7.0 mmol/L或服用降血糖藥物；吸煙的標準為正在吸煙>5支/d或有吸煙史，血脂異常的標準為總膽固醇(TC)≥5.62 mmol/L和/(或)甘油三酯(TG)≥1.92 mmol/L或服用降血脂藥物。
1.2 方法
1.2.1 提取基因組DNA
入選者均于清晨空腹抽取靜脈血1 ml，加20 μl EDTA（濃度150 ng/ml）抗凝，4℃冰箱短期存放。采用UltraPureTM基因組DNA提純試劑盒（北京賽百盛公司生產），提取的基因組DNA置于-20℃保存。
1.2.2 目的基因片段PCR擴增方法
引物參照Uwabo等〔3〕的設計。正義寡核苷酸序列為5′GGGAACCTCAGCCCAGTAGTGAA3′，反義寡核苷酸序列為5′GTGGTCACAGGCGTTCCAGTAAC3′。反應總體系50 μl，其中10×Buffer 5 μl，dNTPs 1 μl，引物各5 μl，模板DNA 2 μl（約150 ng），Taq酶1.5 U（0.3 μl），甲酰胺1μl，用雙蒸水補齊至50 μl。反應條件：預變性94℃ 3 min后進入循環，每個循環為：變性94℃ 45 s，退火56.5℃ 45 s，延伸72℃ 45 s，35個循環后72℃延伸12 min終止反應。取3 μl PCR擴增產物在6％非變性聚丙烯酰胺凝膠上做垂直電泳，電壓60 V，時間3 h，以pGEM7Zf(+)HaeⅢ Marker（華美公司生產）為參照，在0.5 μg/ml溴化乙錠染液中染色40 min后在紫外線燈下觀察結果并照相。
1.3 統計學分析
采用SPSS統計軟件，計量資料組間比較用非配對的t檢驗，計數資料組間比較用χ2檢驗，應用Logistic回歸分析計算比數比并進行危險因素獨立性分析。
2 結 果
2.1 病例組與對照組各種危險因素比較
吸煙、高血壓、糖尿病等在病例組的比例均較對照組高（P0.05），見表1。表1 兩組各危險因素的比較〔n(略)〕
2.2 eNOS基因VNTR多態性電泳結果
eNOS基因VNTR多態性主要有2種等位基因，27 bp的序列重復4次為a，重復5次為b，在電泳圖中分別為417 bp和444 bp的片段，從而構成3種基因型(aa，ab，bb)，見圖1。
2.3 兩組eNOS基因型和等位基因頻率的比較
病例組與對照組的ab基因型頻率分別為22.3%和12.4%，兩者比較有顯著差異(P
2.4 病例組各種危險因素的獨立性分析
病例組各危險因素及eNOS VNTR多態性的比數比（OR）分析及95％可信區間（95% CI），見表3。通過對各種危險因素的多元Logistic回歸分析發現，高血壓、糖尿病、吸煙及ab基因型與老年缺血性腦卒中均明顯相關，是老年缺血性腦卒中的獨立危險因素。表3 病例組各危險因素以及ab基因型的OR值及95％CI（略）
3 討論
NOS是NO合成的關鍵酶，可催化精氨酸代謝為NO和瓜氨酸。根據細胞和組織來源分為3種：神經元型(nNOS)、內皮細胞型(eNOS)和免疫型NOS(iNOS)。eNOS主要存在于血管內皮細胞中，可以被多種介質激活，包括乙酰膽堿、P物質、組氨、精氨酸、血管加壓素、緩激肽、前列腺素F和內皮素R等。eNOS的激活導致內皮細胞中NO的產生增加，并引起一系列的生物學效應，如舒張平滑肌細胞，抑制血小板聚集和黏附于血管內皮，抑制血管平滑肌細胞的增生，阻礙低密度脂蛋白的過氧化而發揮抗動脈粥樣硬化作用等。NO還可通過抑制內皮素和血管緊張素的產生從而抑制血管平滑肌細胞的增生。
人類eNOS的編碼基因位于第7號染色體長臂（7q36），含有26個外顯子和25個內含子，總長21 kb，編碼產物為含有1 203個氨基酸的蛋白質。該基因存在多個多態性位點，其中研究最多的是4號內含子的VNTR多態性、7號外顯子G849T多態性和啟動子區T786C多態性。VNTR多態性主要有2種等位基因，27 bp的序列重復4次為a，重復5次為b，從而構成3種基因型(aa，ab，bb)。eNOS基因多態性可影響eNOS的功能，導致血管系統中NO濃度改變，并由此影響動脈粥樣硬化的發生和發展，因此可能與冠心病和缺血性腦血管疾病有關。
eNOS基因不同位置的變異與心腦血管疾病的相關性不同。1996年Wang等〔4〕發現，澳大利亞長期吸煙者的eNOS第4號內含子基因多態性與冠心病關系密切，吸煙和eNOS4a/a分別在環境和遺傳方面是導致冠心病的主要因素。Lee等〔5〕對韓國男性冠狀動脈疾病病人暷研究也發現eNOS基因a/b多態性與小于51歲的男性患者的冠狀動脈疾病的發展有相關性。Salim等〔6〕發現冠心病患者的等位基因a的頻率明顯高于對照組。Hou等〔7〕對中國人的研究，證實了eNOS第4號內含子基因多態性可能是中國人缺血性腦血管疾病的獨立危險因素，在無常見危險因素的缺血性腦血管病患者中尤為顯著。
eNOS基因多態性與冠心病、心肌梗死的關系得到了多國學者的肯定，但也存在分歧。德國學者Sigusch等〔8〕栐1 043例歐洲人的研究表明，冠心病及其嚴重程度與eNOS4a/b多態性無相關性。Yahashi等〔9〕對日本人該基因多態性與缺血性卒中的關系進行了研究，127例患者（其中18例為血栓栓塞，58例為腔隙性腦梗死，51例為無癥狀性腔隙性腦梗死）與91例對照的b等位基因頻率之比為0.862/0.868，缺血性卒中亞組中等位基因的頻率之比為0.889/0.862/0.853，其差別均無統計學意義。MacLeod等〔10〕在361例缺血性卒中患者與236例對照中，對eNOS基因7號外顯子的G894T多態性進行了相關研究，發現NN基因型在兩組中的分布無差異，提示該多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死和TIA無關。
本研究發現老年缺血性腦卒中組ab基因型的頻率較對照組明顯增高（22.3% vs 12.4%），a等位基因的頻率在病例組也明顯偏高（12.9% vs 7.0%）。用多元Logistic回歸分析校正了年齡、高血壓、糖尿病和吸煙等危險因素的影響后，ab基因型較bb基因型的OR為1.98（95% CI=0.87～3.56，P< 0.05），與Hou等〔7〕報道的結果一致，更進一步證實了在中國人群中eNOS基因VNTR多態性與缺血性腦卒中有相關性，ab基因型可能是影響中國老年人發生缺血性腦卒中的獨立危險因素。
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關鍵詞：ADH2；ALDH2；基因多態性；飲酒；胃癌
中國分類號：R183.3*2文獻標志碼：B
胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，而有關飲酒與胃癌的關系研究頗多，研究結論各異。部分研究認為飲酒不是獨立的危險因素或危險因素很弱，而乙醇脫氫酶2(ADH2)、乙醛脫氫酶(ALDI-L2)基因多態性與胃癌易感性也存分歧。ADH2和ALDH2是酒精代謝的兩種酶，前者將乙醇氧化成乙醛，而后者將乙醛氧化成醋酸。ADH2和ALDH2的編碼基因有高度的多態性，ADH2可分為G／G(變異型純合子)、G／A(雜合子基因型)和A／A(野生型純合子)3種基因型，ALDH2也可分為G／G(野生型純合子)、G／A(雜合子基因型)和A／A(變異型純合子)3種基因型。為探索ADH2、ALDH2基因多態性及飲酒與胃癌的聯系，為此類研究提供有關數據，結合有關專題開展本研究。
1 資料與方法
1.1 資料來源
病例來自常熟市2005年8月-2006年8月期間經市二級醫院確診，具有本地區常住戶口男性原發胃癌新發病例，病例均經手術或病理確認。常熟市疾病預防控制中心登記201例，其中161例新發病例是通過原發灶病理診斷。對照組采用隨機抽樣的原則，抽取同性別、上下年齡不超過2歲、與病例居住在同村、或同一鄉鎮有常熟市常住戶口的非腫瘤居民，病例組平均年齡為64.65歲，對照組199例，平均年齡為64.61歲。
1.2 方法
采用統一的調查表由經專門培訓的調查員通過訪談的方式調查每位研究對象，并由質控人員對每張調查表進行審查和驗收，對可疑項目重新調查。調查項目包括調查對象的一般情況、飲酒情況等內容。對全部研究對象抽靜脈血，置乙二胺四乙酸鈉抗凝管，分離白細胞層。用Q IAamp DNA提取試劑盒提取白細胞DNA，DNA置－30℃低溫冰箱保存備用。飲酒定義為：相當于每周飲高度白酒至少1次，連續半年以上。酒精消耗總量，按照含酒精飲料中純酒精量計算，以“千克?年”為單位(平均每天飲純酒精的千克數×飲酒年數)。含酒精飲料的酒精濃度參照《中國食物成分表2004》計算。
1.3 基因型分析
采用多聚酶鏈反應(PCR)和變性高效液相色譜法(DHPLC)檢測ADH2 Arg47His和ALDH2 Glu487Lys基因型。ADH2Arg47His擴增所用引物為F：5‘-GGG CTrTAG ACTGAA’FAA CCTTGG-3‘和R：5‘-AGG GAAAGA GGA AAC TCC TGA A-3‘。ALDH2 Glu487Lys擴增所用引物為F：5’TGCTATGATGTGTITGGAGCC和R：5’－GGC TCC GAG CCA CCA-3‘。雜合子基因型可從DHPLC圖形直接確定，野生型純合子和變異型純合子的DHPLC圖形相同，需與已知純合型混合，經過變性和復性過程，再次上樣DHPLC儀分析確定。檢測基因擴增產物購自寶生生物工程有限公司，PCR產物上樣鑒定儀器為WAVE-3500(Transgenomic，USA)。
1.4統 計學分析
數據錄入用Epidata 3.0軟件，用SAS 8.0軟件進行統計分析，以比值比(OR)及95％可信限(95％)表示相對危險度。
2 結果
2.1 兩組均衡性檢驗
對病例組和對照組文化程度以及職業等一般情況進行均衡性檢驗，結果見表1，兩組相關因素無統計學差異(P>0.05)。
2.2 ADH2和ALDI-12基因不同分型與胃癌的關系
分別以ADH2基因野生型(A／A)和ALDH2野生型(G／G)，ADH2基因非野生型和ALDH2基因非野生型的組合與之比較分析，結果見表2。無論是ADH2基因型還是ALDH2基因型，雜合子基因型和變異型純合子并未增加胃癌的危險性，差異均無統計學意義(P>0.05)。
2.3 ADH2和ALDI-12基因不同分型組合與胃癌的關系
以病例和對照ADH2基因野生型(A／A)和ALDH2基因野生型(G／G)為參照，ADH2基因非野生型和AL-DH2基因非野生型的組合與之比較分析，結果見表3。ADH2基因雜合子基因型、變異型純合子和ALDH2基因雜合子基因型、變異型純合子的不同組合，并不增加胃癌的危險性，差異均無統計學意義(P>0.05)。
2.4 飲酒與胃癌的相關性
對是否飲酒以和胃癌的相關性進行分析研究，結果見表4，進行趨勢性檢驗，結果差異均無統計學意義(P>0.05)，未發現胃癌與飲酒有相關性。
2.5 ADH2、ALDH2基因不同基因組合及飲酒與胃癌的關系
根據代謝活性高低以飲酒者的ADH2基因和ALDH2基因型的任意組合和不飲酒者代謝酶活性高的ADH2野生型(A／A)和ALDH2野生型(G／G)組合進行比較，比較時以酒精消耗量1.5千克?年進行分層，其結果見表5。任何其它組合即使酒精消耗量高于1.5千克?年，都未能增加胃癌的危險性，差異均無統計學意義(P>0.05)。
3 討論
胃癌的危險因素比較復雜，而有關飲酒和胃癌之間的爭議一直很大。張栓虎有關飲酒與胃癌發病關系的Meta分析中，27個研究中有4個OR值無顯著性意義。鮑萍萍等研究發現，上海地區男性居民飲酒和胃癌的病例對照研究中，沒有發現飲酒和胃癌有相關性，而女性重度飲酒者與胃癌有關。認為是不同性別對酒精的反應不同。
【關鍵詞】 食管鱗狀細胞癌；類胰島素生長因子1；微衛星多態性
Abstract Objective: To investigate the relationship between a microsatellite polymorphism (CA repeats) in the insulin-like growth factor I gene and the risk of esophageal squamous cell carcinoma. Methods: IGF-Ⅰ microsatellite polymorphism was genotyped among 78 cases with esophageal squamous cell carcinoma and 470 normal controls by fluorescent labeled fragment analysis. And data were analyzed using unconditional logistic regression to evaluate the association of examined polymorphism with esophageal squamous cell carcinoma. Results: No association was found between IGF-Ⅰ microsatellite polymorphism and esophageal squamous cell carcinoma. Conclusion: IGF-Ⅰ microsatellite polymorphism (CA repeats) does not play a major role in the development of esophageal squamous cell carcinoma.
Key words Esophageal squamous cell carcinoma; Insulin-like growth factor I (IGF-Ⅰ); Microsatillite polymorphism
類胰島素生長因子1（IGF-Ⅰ）是一種多功能肽，能夠促進細胞的增殖、分化和抑制細胞的凋亡[1]。有研究顯示IGF-Ⅰ在癌癥的發生過程中起到了重要作用[1]，而其基因的啟動子區域有一個高度多態性的微衛星標記，即CA重復與血循環中的IGF-Ⅰ水平相關聯[2]。有一些研究已經檢測了這一多態性與乳腺癌、前列腺癌和結腸直腸癌的關系，但結果不太一致[3-6]。到目前為止未見有這一多態性與食管癌關系的報道，因此在本研究中，我們檢測了兩者之間是否關聯。
1 材料與方法
1.1 樣本 我們收集了78例食管鱗狀細胞癌患者為觀察組，470例為正常對照組。觀察組所有病例均經病理學確診，年齡范圍48～79歲，平均年齡64歲，其中男性57例，女性21例。正常對照組年齡范圍48～80歲，平均年齡62歲，其中男性388例，女性82例。
1.2 基因分型 我們用酚/氯仿抽提法提取DNA，然后采用熒光標記片段分析法進行基因分型。15μL PCR反應體系中含有25ng基因組DNA，200μM dNTPs，0.3μM引物（F:5'-FAM-GCTAGCCAGCTGGTGTTATT-3';R:5'-ACCACTCTGGGAGAAGGGTA-3'），2.5mM MgCl2，0.6U DNA聚合酶。PCR的反應條件為：95℃預變性12分鐘，然后10圈循環，每一循環中94℃預變性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒；然后再20圈循環，每一循環中89℃預變性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒；最后72℃再延伸5分鐘。擴增后，1μL PCR產物和9μL Hi-DiTM甲酰胺以及0.5μL GeneScanTM-500LIZTM標準大小片段混合，在ABI 3730分析儀上進行毛細管電泳，并用GeneMapper 4.0生物軟件分析樣品基因型。
1.3 統計分析 我們用Monte-Carlo法檢測基因型分布在正常對照中是否符合Hardy-Weinberg平衡；非條件性Logistic回歸分析來估計相對發病風險，并以優勢比（ORs）和95%可信區間（95% CIs）表示。所有的OR值都平衡了性別、年齡、吸煙和飲酒等因素的影響。在本研究中，IGF-Ⅰ基因型分為3組：（1）最常見等位基因192bp純合子；（2）192bp雜合子；（3）其它。
2 結果
在本研究中，IGF-Ⅰ基因微衛星多態性CA重復顯示有9個等位基因，長度從184bp到200bp，最常見等位基因為192bp，等位基因分布在觀察組和對照組中差異沒有統計學意義，見表1。在正常對照組中，基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，這一多態性與食管鱗狀細胞癌的發病沒有關聯，見表2。表1 IGF-Ⅰ (CA)n等位基因在樣本中的分布表2 IGF-Ⅰ (CA)n 基因型與食管鱗狀細胞癌的關聯
3 討論
食管癌是一種高度致死性癌癥，其5年生存率僅為10%，目前改善其低生存率只能通過早期腫瘤篩查獲得 [7]，因此識別一些高度易感人群對疾病的防治是非常重要的。
大量證據顯示IGF-Ⅰ系統在食管癌的發病過程中作用顯著。一些研究提示在人類食管癌中IGF-Ⅰ可通過自分泌作用刺激腫瘤細胞的生長[8-9]；而一些群組研究（cohort study）也顯示血清中IGF-Ⅰ水平升高與食管癌的發病風險呈顯著關聯[10-11]。由于血循環中IGF-Ⅰ的濃度并不總是能直接反映局部組織中的產生量，因此識別一些基因多態性可能會幫助我們鑒別IGF-Ⅰ在局部和全身中的長期暴露水平。
雙生子研究顯示不同個體IGF-Ⅰ水平不同，大約有40%～60%是由遺傳因素決定的[12]。在本研究中我們所檢測的微衛星多態性CA重復位于啟動子區域，在轉錄起始位點上游約1 kb處，而且含有特異的調控元件[13]。因此，這一多態性等位基因的改變可能導致IGF-Ⅰ基因轉錄的改變；或者這一多態性與其它位于啟動子區域或其附近的多態性處于連鎖不平衡，從而影響IGF-Ⅰ mRNA的穩定性或IGF-Ⅰ的半衰期[14]。雖然有研究顯示這一多態性與血循環中的IGF-Ⅰ水平相關聯[2]，然而我們的研究并不支持它與食管鱗狀細胞癌的發病相關聯。但是，我們的樣本量只有約80%的效能檢測到最低OR值為2，因此，我們并不能排除這一多態性對疾病的OR值低于2的效應，關于IGF-Ⅰ微衛星標記CA重復與食管鱗狀細胞癌關系的最終結論還需要許多其它大的研究來確證。
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[關鍵詞] 腫瘤壞死因子；基因多態性；易感基因
[中圖分類號]R73[文獻標識碼]A [文章編號]1673-7210（2007）05（c）-004-03
腫瘤壞死因子（TNF）是體內具有多種生物活性的細胞因子，根據其來源不同可分為兩種：TNF-α和TNF-β。它們主要是由單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞分泌的細胞因子，可以誘生TNF自身和IL-1、IL－6等其他細胞因子，增加HLA－I、HLA－II類抗原表達，促進B、T細胞增殖和免疫球蛋白的合成，具有廣泛的誘導炎癥和免疫調節功能。編碼TNF-α和TNF-β的基因分別稱為TNF-α基因和TNF-β基因，與MHC基因緊密連鎖，TNF-α基因和TNF-β基因位于HLA-DR以及HLA-B位點之間的HLA-III抗原基因簇，即6p21.3[1]。
1 TNF基因多態性
TNF－α基因由4個外顯子和3個內含子及5'端非翻譯區及3'端非翻譯區組成，近來研究表明，TNF－α有16個多態性位點，包括5個微衛星、10個復等位基因和一個1C插入位點，其多態性位點已證實的有：－308、－238、＋70和－376位點的GA堿基變化，－863位點CA、－1031位點TC、－857及－850位點CT的堿基變化，其中4個多態性位點在TNF－α基因啟動子區域[2]。Wilson等[3]首先報道了TNF－α基因啟動子區域內轉錄起始點上游第308位點的雙等位基因多態性，308位點為鳥嘌呤核苷酸G時，定義為TNF1，308位為腺嘌呤核苷酸A時定義為TNF2，TNF1較常見，TNF2較罕見。這一位點的突變造成了限制性內切酶（Nco I）識別位點的缺失，使被A替代的核苷酸序列不能被Nco I識別并切斷，即限制性片斷長度多態性（RFLP）。另有研究表明，TNF2因能通過增強轉錄產生更多的TNF－α，故也將其稱為TNF－α高產型。Wilson等的研究表明，該多態性位點在白色人種與HLA－DR3 連鎖不平衡相關；且－308A等位基因與HLA－DR3、A1、B8單倍型顯著相關[4]。但也有學者認為TNF－α基因多態性是獨立于HLA之外的一類疾病風險因子，因而其表達產物TNF－α與HLA基因型無關。TNF－β基因多態性位點在第一內含子、轉錄起始位點下游第252位點（＋252位點）的鳥嘌呤核苷酸G被腺嘌呤核苷酸A替代，這一位點的突變使Nco I識別序列發生了變化，致使被A所替代的核苷酸序列不能被Nco I識別并切斷。TNF－β基因多態性還包括：5'非翻譯區的一個多態性殘基、3'非翻譯區的一個EcoR I限制性片斷長度多態性、在外顯子3'處有一個替換及多個TNF微衛星等位基因[2]。
2TNF基因多態性與有關易感性惡性腫瘤
2.1 消化道惡性腫瘤
TNF－α在肝壞死性炎癥、纖維形成、肝細胞癌變的過程中起著重要作用。Suneetha等[5]研究表明，HBV感染后肝損傷嚴重的患者和肝損傷輕微的患者中，TNF－β等位基因的分布頻率有顯著區別。嚴重肝損害患者TNF－β A/A等位基因出現頻率要明顯高于對照組。而TNF－α－308位點的基因多態性似乎與肝損傷的嚴重程度不相關。Kim等[6]的研究表明，TNF-α-308A（TNF-α-308 A/G或A/A）或－863位A缺失（TNF-α-863 C/C）變異體與HBV感染的消除有關。TNF-α單倍體1（－1 030T；－863C；－857C；－308G；-238G；－163G）和單倍體2（－1 030C；－863A；－857C；－308G；-238G；－163G）與HBV的清除、保護性抗體的產生相關。目前還未見有文獻報道TNF基因的多態性與肝癌的易感性有關，但肝炎后引起的肝損害是肝癌發病的高危因素。Lee等[7]的研究表明， TNF-α－308位點的基因多態性的分布頻率在胃癌組與正常對照組中無顯著性差異，且和胃癌的組織學類型無相關性。Perri等[8]研究表明，在意大利的兩個胃癌的高發地區和低發地區，TNF－α－308位的多態性和基因頻率與胃癌無相關性，并且在HP陽性組和陰性組中，TNF－α－308基因的分布頻率沒有明顯的差別。但另有研究表明，TNF－α－308A等位基因與HP感染相關。Ohyama等[9]的研究表明，TNF－α－857基因(C/C,C/T,T/T)的分布頻率在胃癌組和正常對照組中無顯著差別，TNF－α－857 T/T和HP感染與增生性胃炎相關，TNF－α－857T等位基因可能促進胃癌擴散。Lee等[10]分析了韓國人口中5種TNF－α啟動子多態性(-1 031,-863,-857,-308和-238)及2種TNF－β多態性（內含子1和蘇氨酸26天門冬酰氨）在胃癌組、十二指腸潰瘍組和正常對照組間的不同，發現單獨的多態性與胃癌和十二指腸潰瘍的發病風險不相關。對7種多態性進行單倍體分析，單倍體型在對照組、胃癌組和/或十二指腸潰瘍組間區別不明顯，但個體單倍體C和D（在－1031，－863和－857位點上有相反的等位基因）的頻率在胃癌組和十二指腸潰瘍組間有顯著差別，這提示TNF/LTA基因型在胃癌和十二指腸潰瘍的發病機制上起完全不同的作用。
2.2 呼吸系統腫瘤
Selfart等[11]研究了117名肺癌患者（包括77名非小細胞肺癌患者和40名小細胞肺癌患者）和131名健康人TNF－α－238和TNF－β－Intron1－252的基因多態性，發現非小細胞肺癌組TNF－α－238和TNF－β－Intron1－252的基因多態性與對照組相比有顯著性差異，而小細胞肺癌組與對照組相比則無顯著性差異。
2.3血液系統腫瘤
Mainoufowler等[12]報道的54例來自北歐的非霍奇金淋巴瘤LT－α＋252位多態性檢測結果表明該位點的等位基因頻率與對照組無顯著性差異。近來，Chouchane等[13]對124例來自突尼西亞的惡性腫瘤患者進行了研究（其中NHL 44例、乳腺癌40例、其他腫瘤40例），發現惡性腫瘤患者TNF2等位基因頻率較正常對照組明顯升高，而TNF1基因型則明顯降低，提示該純合型可能是一個抑癌的保護型；相反，攜TNF1/2雜合型患者患NHL的危險性增高，這一結果似乎表明TNF的多態性與NHL發生的易感性有關。但Bilkay等[14]卻得出了不同的結果，他們調查了273例來自法國的NHL患者，發現TNF－308位合LTα＋252位等位基因頻率與對照組相同，提示其多態性與淋巴瘤的發生無關。Demeter等[15]檢測了73例CCL的德國患者TNF－308位和LTα＋252位等位基因，發現CLL患者TNF1等位基因頻率明顯升高，但與疾病進展無關，而LTα＋252位等位基因頻率患者組與對照組無顯著性差異，但在進展期CLL患者中的該等位基因頻率增加，再發生自身免疫性溶血性貧血的CLL患者中，大部分人攜有LTα＋252位等位基因。這些研究表明，低水平的TNF－α/LTα與CLL的發生發展有關，與細胞因子自分泌、旁分泌有關的免疫基因在CLL的病情進展中起作用。
2.4 泌尿系統腫瘤
Bilkay等[15]分析了腎細胞癌患者中TNF－α－308 G/A的基因多態現象和等位基因分布頻率，結果提示TNF－α－308 G/G基因型可能是保護性因素，但基因多態現象和等位基因分布頻率與對照組相比無明顯差別。Nakajima等[16]分析了81例來自日本的腎細胞癌患者TNF－α－238、－308、488位點的三個基因多態現象，結果發現在－238和488位點GA的突變和GA基因型在晚期腎細胞癌患者中較常見，－238和488位點的基因多態現象與腎細胞癌病程發展相關。Bong等[17]分析了73例前列腺癌患者TNF－α基因啟動子-308位點及488位點基因多態性現象,發現-308位點GA基因型及488位點GA基因型在前列腺癌患者中較為多見,因此推測TNF－α基因-308位點及488位點基因多態性與前列腺癌易感性相關。March等[18]研究了膀胱癌患者中TNF－α 488及-859兩個位點的多態性，發現TNF－α 488A和TNF－α-859T與膀胱癌發生密切相關,并且這些基因的多態性與腫瘤分期有關。
2.5其他惡性腫瘤
Smith等[19]研究了144例女性乳腺癌患者TNF－α-308位點的基因多態現象,發現-308位點的GG基因型比其他基因型個體更易患乳腺癌。Sarvestani等[20]研究了233名來自伊朗的女性乳腺癌患者TNF－α-308位點及TNF-β 252位點的基因多態現象,認為這兩個位點的基因多態現象與乳腺癌的易感性無相關性。Duarte等[21]研究了195名進展期宮頸癌患者TNF－α-308位點的基因多態現象,發現-308AA基因型在宮頸癌患者中較為常見,然而這并沒有統計學意義,這可能和AA基因型在人群中較為罕見有關。Deshpande等[22]研究了宮頸癌患者TNF的11個多態性位點，發現-572、-857、-863位點的基因多態現象與宮頸癌的易感性相關。Skov等[23]研究了TNF－α-308位點的基因多態現象與基底細胞癌的易感性之間的關系,發現基底細胞癌的發生與TNF－α的高水平表達相關,但未發現其易感性與此位點的基因多態現象有關。Pandey等[24]研究了TNF－α基因多態現象與肉瘤的易感性的關系,發現TNF－α-308位點及-238位點的基因多態現象與肉瘤的易感性之間無明顯關系。
3 結語
綜上所述,TNF基因的多態性與某些惡性腫瘤的發生、發展和預后有關,由于TNF基因的多態性造成TNF轉錄水平的變化，進而影響TNF的表達,而TNF直接或間接參與腫瘤的發生、發展,因此TNF基因多態性可作為某些腫瘤易感性的遺傳標志,隨著對TNF基因多態性與腫瘤的易感性等研究的不斷深入,必將從基因水平對某些腫瘤的病因、病理生理等方面的認識產生一個新的飛躍。
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【關鍵詞】Graves??；細胞間粘附因子1；基因多態
The associative study of Intercellular adhesion molecule 1’s gene polymorphism in Graves disease
LI Ying，XU Ai-mei.Qingdao Central Hospital,Shandong Qingdao 266042,China
【Abstract】 Objective To investigate the association between Intercellular adhesion molecule1(ICAM-1)with the polymorphism of it’s the forth exon G241R(721GA)and the sixth exon K469E(1405AG)and the Graves disease of Chinese Hans in northern China.Methods The serum ICAM-1 concentration and the allele of its the forth exon G241R(721GA)and the sixth exon K469E(1405AG)were determined by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)and the PCR sequence-specific primers method(PCR-SSP)in 202 Chinese Hans in northern China,including 139 patients of Graves Disease(GD).According to the age when GD occured,the GD cases were divided into two groups,the early-onset group including 78 cases(
【Key words】Graves disease;Intercellular adhesion molecule 1;Genepolymorphism
Graves病(graves dieases，GD)目前被認為是一種器官特異性自身免疫病[1-2],有顯著的遺傳傾向，目前發現它與HLA類型有關[1]。ICAM-1是一條分子量約80~100ku的糖蛋白，具有5個跨膜結構，是LFA-1分子的天然配體之一，其基因定位在19號染色體上[3-4]。GD最顯著的病理組織學特點是甲狀腺、眼睛等效應器官內淋巴細胞的浸潤，血液循環中的淋巴細胞向效應部位的遷徙首先是通過其與血管內皮細胞的相互作用來啟動，二者相互作用的前提是內皮細胞的活化，ICAM-1可以加強內皮細胞的活化過程[5]。
1 材料與方法
1．1 研究對象及分組
1．1．1 研究對象 202名無血緣關系的山東地區漢族人，均為青島市中心醫院內分泌科住院或門診患者及體檢健康成人，其中初診未治療GD患者139名，均具有典型的高代謝癥群，不同程度彌漫性甲狀腺腫伴或不伴甲狀腺外損害(眼征，脛前黏液性水腫)，實驗室檢查血FT3>5．6 pmol/L，FT4>25．5 pmol/L，sTSH
1．1．2 分組 GD組 139例，男/女=26/103，年齡16~67歲，平均(45．24±7．26)歲。根據發病年齡分為兩個亞組：①早發GD(EGD)組：發病
正常對照(CON)組共63例，男/女=13/50，年齡18~68歲，平均(46．97±6．74)歲。
設計、實施、評估者：上述實驗設計為第一作者實施，各項生化指標測定均由接受過專業培訓的固定實驗人員完成。
1．2 實驗方法
1．2．1 受試者均于隔夜空腹抽靜脈血5 ml，室溫靜置30 min，3 000轉離心15 min，分離血清；應用電化學發光儀(德國羅氏公司生產Elecsys2010型)立即測定FT3、FT4、TSH、、TGAB、TPOAB。所有標本統一編號保存，其余各項指標均統一標準，一批完成測定。
1．2．2 取ACD抗凝全血300 ul，用Promega公司的全血DNA抽提試劑盒，提取基因組DNA。①應用PCR-SSP方法，擴增包含ICAM-1基因第4外顯子721GA位點與第6外顯子1405AG位點的基因片段，同時擴增腺瘤樣息肉基因第15外顯子的一段256 bp片段作為內對照鏈；上游序列：兩條721位點和一條對照鏈上游引物：1：5'-GTGGTCTGTTCCCTGGACG-3'(代表721位點為G)；2：5'-GTGGTCTGTTCCCTGGACA-3'(代表721位點 A)；3：5'-ATGATGTTGACCTTTCCAGGG-3';下游序列：兩條1405位點和一條對照鏈下游引物：4：5'-GCACATTCACGGTCACCTC-3'(代表1405位點為G)5：5'-GCACATTCACGGTCACCTT-3'(代表1405位點為A)6：5'-TTCTGTAACTTTTCATCAGTTGC-3';②反應體系置于PCR擴增儀，96℃預變性2 min，96℃變性30 s循環6次，69℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環35次后于72℃終延伸5 min;③2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物：取PCR擴增產物6 μl，按5：1(V/V)與6×上樣緩沖液混合后，上樣與2%瓊脂糖凝膠(含0．5 μg/ml EB)，0．5×TBE中80V電壓電泳30 min，與紫外透射儀下觀察結果。用DNA Marker 作對照，可觀測到兩種長度為269 bp和967 bp的擴增片段;④電泳結果的分析：由于引物序列的特異性，對于上游序列，只在含有上游引物1的反應體系中顯示有967 bp擴增片段的表明721位點為GG基因型，只在含有上游引物2的反應體系中顯示有967 bp擴增片段的表明721位點為AA基因型，而在含有上游引物1、2的反應體系中均顯示有967 bp擴增片段的表明721位點為GA基因型；同樣分析下游位點，顯示1405位點有GG、GA、AA三種基因型。對于具體患者，共有GGGG、GGGA、GGAA、GAGG、GAGA、GAAA、AAGA(前兩個字母代表721位點，后兩個字母代表1405位點)七種基因型。
2 結果
2．1 各組一般臨床資料 正常對照(CON)組與甲亢(GD)組的年齡、性別構成比均無顯著性差異(P>0．05)、FT3、FT4、TSH、TRAB、TGAB、TPOAB均有顯著性差異(P0．05)。(見表1)。
2．2 ICAM-1基因第4外顯子721GA多態與GD的相關性
2．2．1 ICAM-1基因第4外顯子721GA多態檢測結果 在PCR擴增結果中顯示引物1、4組或1、5組反應體系得到片段的，證明第4外顯子721位為G等位基因；而引物2、4組或2、5組反應體系得到片段的，第4外顯子721位為A等位基因。根據等位基因判斷具體患者的基因型有三種情況，分別為GG、GA、AA。(見表2)。
2．2．2 ICAM-1基因第4外顯子721GA多態位點不同基因型和等位基因與GD的相關性 GD組的三種基因型頻率與CON組無明顯差別(P>0．05)，G等位基因頻率和A等位基因頻率與CON組無明顯差異(P>0．05)；但EGD組GA+AA基因型頻率顯著高于LGD組和CON組(P
2．3 ICAM-1基因第6外顯子1405AG多態與GD的相關性
2．3．1 ICAM-1基因第6外顯子1405AG多態檢測結果 在PCR擴增結果中顯示引物1、4組或2、4組反應體系得到片段的，證明第6外顯子1405位為G等位基因；而引物1、5組或2、5組反應體系得到片段的，第6外顯子1405位為A等位基因。根據等位基因判斷具體患者的基因型有三種情況，分別為GG、GA、AA。(見表4)。
2．3．2 ICAM-1基因第6外顯子1405AG多態位點不同等位基因與GD的相關性 GD組的三種基因型頻率與CON組無明顯差別(P>0．05)，GD組的A等位基因頻率和G等位基因頻率與CON組無明顯差異(P>0．05)； EGD組GA基因型頻率與LGD組無明顯差異(P>0．05)，EGD組與LGD組的A等位基因頻率和G等位基因頻率也無明顯差別(P>0．05)。(見表5)。
2．4 統計學方法 計量資料用（x±s）表示，各組均數之間的比較用方差分析。運用Hardy-Weinberg檢驗樣本的群體代表性。用基因計數法計算各組等位基因頻率，各組間等位基因頻率的比較用卡方檢驗，P
3 討論
GD的發病與遺傳密切相關，有明確的臨床資料顯示HLA-Ⅱ等位基因(DR3和DQA10501)和CTLA-4基因多態性與GD發病有關[2，6-7]。另外，基因組研究發現GD的其他遺傳異感基因位點在染色體14Q31，18Q21，20Q11以及XQ21[8-9]。
現在所得出的結論是基于早期關于ICAM-1基因多態性的研究。前期研究發現ICAM-1基因多態性與多種人類自身免疫性疾病有關。外顯子4C721G-A使氨基酸鏈第241位由甘氨酸變為精氨酸,外顯子6C1405A-G使第469位由賴氨酸變為谷氨酸?，F已證實：ICAM-1結合點區(外顯子4)與第五抗原相似區(外顯子6)的基因多態性可以改變ICAM-1的特性：細胞黏附與共同趨化能力[10]。推測這種ICAM-1功能區的氨基酸替代可以改變ICAM-1結構和功能從而影響GD的臨床表現?？梢蕴岣呔奘杉毎δ埽渌庖哌f呈細胞相關的細胞因子(HLA及CTLA-40)的基因多態性可以影響GD的易感性和發病年齡[2，6]。
現已所知ICAM-1的基因多態性可以調節某些自身免疫疾病的免疫狀態[11-12]。例如：1型糖尿病、多發性大動脈炎以及克隆氏病[13-15]。等位基因A(R241)的高表達,C721GA(G241R)以相應的自身抗體在潰瘍性結腸炎患者中發現[16]。另外,與研究結果相一致的是，Nishmura等發現ICAM-1基因的第6外顯子基因多態性與1型糖尿病的發病年齡有關[13]。移植后腎衰的患者ICAM-1基因第C.721位等位基因A是腎移植后長期存活者的兩倍，受者ICAM-1E469的變異與急性的腎移植后腎衰有關[11]。
簡而言之，研究結果顯示ICAM-1基因多態性可能影響甲亢的發病年齡。其原因可能是由于ICAM-1基因多態性造成氨基酸替代而影響自身免疫反應的強度和持續性，是ICAM-1抗原類似區與受體結合后的結果。在動物模型中已經顯示：通過腺病毒基因技術短暫性地阻斷LFA-1/ICAM-1通路可以防止自身免疫的發生而不引起經典的免疫抑制[17]。筆者推測這種技術可以調整ICAM-1的結構，從而推遲GD發病年齡，延長緩解期，以及對GD的臨床表現有一些影響。
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【關鍵詞】 進展性卒中 VEGF936C/T 單核苷酸多態性
Correlative study on 936C/T gene polymorphism of vascular endothelial growth factor（VEGF）and advancing stroke
［Abstract］ Objective To investigate the association between 936C/T gene polymorphism of vascular endothelial growth factor（VEGF）and stroke in progression risk.Methods Using the method of restrictive fragment length polymorphism（RFLP），the VEGF genotypes of 66 stroke in progression patients，134 completed stroke patients and 100 healthy control subjects were detected.The association between VEGF 936C/T gene polymorphism and stroke in progression was compared.Results The frequency of VEGF carreiers with 936T-allele（936CT+936TT）in progression stroke patients was significantly higher than that in control group，while the frequency of VEGF 936T allele in completed stroke was similar with that in control group.There was positive association between VEGF 936T and stroke in progression（OR 1.882;95% CI 1.269～2.789）.Conclusion VEGF 936T-allele can raise the risk of stoke evolution while VEGF 936CC can decrease the risk of stroke in progression.
［Key words］ advancing stroke;VEGF 936C/T;single nucleotide polymorphisms
進展性卒中（stroke in progression，SIP）是指卒中發病后神經功能缺失癥狀在48 h內逐漸進展或呈階梯式加重。其發病率為卒中患者的30%，致殘率和致死率較一般卒中高，是影響病人預后的重要原因之一，也是腦血管病治療中的難點。目前，已經發現的危險因素有高血壓病、糖尿病、感染、人皰疹病毒感染和腦血管狹窄等。盡管我們對以上危險因素進行了積極的防治，仍有一部分患者會進展。說明進展性卒中的病因仍沒有完全闡明。遺傳、多基因、多態性這三個方面是進展性卒中研究的熱點。應用單核苷酸多態性進行遺傳性相關性研究，可以為腦卒中進展的危險性提供預示作用。
血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）因其可以增加血管通透性，誘導血管新生，促進缺血部位側支循環的建立，使其成為目前缺血性疾病研究的熱點之一。腦血管內皮細胞的凋亡和缺血半暗帶細胞的壞死是進展性卒中的發病機制。然而，發生在VEGF基因3’端非轉錄區936位點的常見突變，即C-T易位，其中，VEGF936T據報道與VEGF的低血漿水平顯著相關［1］。國內外有研究證實，VEGF936T與乳腺癌［2］、糖尿病腎病等的發生密切相關。基于上述，我們推測VEGF936C/T多態性與進展性卒中相關?，F探討VEGF 936T與進展性卒中的相關性如下。
1 對象與方法
1.1 研究對象 2005年1月～2006年1月期間哈爾濱醫科大學附屬二院神經內科病房的住院患者200例，男107例，女93例，年齡35～75歲，平均（62±10.3）歲，排除其他腫瘤性疾病。按病變進展情況分為普通腦梗死組134例和進展性卒中組66例。對所有患者標明有無進展性卒中可能的危險因素［3］（糖尿病、高血壓病、感染、腦血管狹窄＞50%、高血脂、高尿酸、高纖維蛋白原），同時選取與病例組的性別和年齡相匹配的健康志愿者100例作為對照組。所有研究對象均為東北漢族人。
1.2 儀器與試劑 人血基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）由TIANGEN-QIAGEN提供；Taq酶、dNTP、10×loading buffer、20bp DNA marker購自Takara公司；NIaⅢ限制性內切酶購自NEB；VEGF引物合成由美國ABI公司完成。
1.3 方法 用RFLP法鑒定VEGF的基因型。抽取每位受檢者空腹靜脈血3ml，按照常規方法從白細胞中提取基因組DNA，4 ℃保存。PCR引物參照文獻［2］設計并合成，正向引物：5’-AAGGAAGA GGAGACTCTGCGC-3’，反向引物：5’-TATGTGGGTGGGTGTGTCTA CAG-3’。PCR反應體系50 μl，包括正向反向引物各1 μl、dNTP4 μl、模板DNA 8 μl、Taq酶1 μl、ddH2O 30 μl、lodding buffer 5 μl。PCR反應條件：95 ℃預變性4min、95 ℃變性30s、60 ℃退火45s、72 ℃延伸45s、30個循環后、72 ℃再延伸5min。產物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，為198bp。PCR產物用限制性內切酶NIaⅢ（New England Biolabs）5 u于37 ℃消化3 h后，再經4%瓊脂糖凝膠電泳鑒定VEGF基因型。
1.4 統計學方法 所有數據應用windows SPSS 13.0統計軟件進行分析。Hardy-Weinberg平衡和計數資料用 χ2檢驗；通過Logistic回歸篩選進展性卒中的危險因素，優勢比（odds ratio，OR）用來衡量卒中進展的風險性。P＜0.05表示差異有統計學意義。
2 結果
用RFLP法鑒定VEGF的基因型，其電泳結果見圖1。VEGF 936C不被分解（198bp），而VEGF936T被分解為兩段（分別為114bp和84bp）。糖尿病、高血壓病、感染、腦血管狹窄和VEGF936T攜帶者均是進展性卒中的危險因素。病例組和對照組的基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，進展性卒中組與普通腦梗死組基因型分布情況比較見表1；進展性卒中組與健康對照組基因型分布情況比較見表2；普通腦梗死組與健康對照組基因型分布情況比較見表3。說明進展性卒中組和普通腦梗死組的VEGF936 C/T基因型分布不同，不能認為普通腦梗死組和健康對照組的VEGF936C/T基因型分布相同。進展性卒中組VEGF936T等位基因攜帶者的頻率為50%，顯著高于普通腦梗死組的31.3%，進展性卒中的936T等位基因攜帶者的比值比OR值為1.882，95%的可信區間為1.269～2.789，見表4。說明VEGF936T等位基因攜帶者與VEGF936CC純合子的患者相比卒中進展的風險性會增高1.882倍。表1 進展性卒中組和普通腦梗死組VEGF936基因型分布的比較 表2 進展性卒中組和健康對照組VEGF936基因型分布的比較表3 普通腦梗死組和健康對照組VEGF936 基因型分布的比較表4 進展性卒中VEGF936T有關參數的估計值
3 討論
通過對VEGF 3’端非轉錄區936位點基因多態性在進展性卒中組、普通腦梗死組和健康對照組中的比較，我們發現，936C/T突變減少了VEGF的表達，VEGF936T與進展性卒中相關。該結果顯示，VEGF基因多態性，至少在東北漢族人中，是進展性卒中的主要遺傳危險因子；然而，我們不能排除VEGF基因的其他一些至今未知的突變，以及另外一些基因的突變在進展性卒中的易感性危險因素中起一定作用。
VEGF可以增加血管通透性，誘導血管新生，同時，VEGF作為局部內生性調節劑，能夠保持內皮細胞的完整性，維持內皮細胞的正常功能，從而避免觸發內源性或外源性凝血途徑［4］。研究發現VEGF還能夠增加絲氨酸蛋白酶、纖維蛋白溶解酶、尿激酶和組織型纖溶酶原的表達和活性，從而發揮抗血栓形成作用［5］。目前國外有文獻報道，VEGF對缺血腦細胞DNA損害與修復具有重要影響［6］，另有文獻報道，VEGF可誘導抗凋亡蛋白的表達，是內皮細胞的一個生存因素。如果VEGF的量低于閾值，腦血管內皮細胞將因為VEGF依賴的內皮細胞生存過程的縮短而程序性死亡［7］。因此VEGF可以通過阻止血栓進展、溶解已形成的血栓，建立側支循環、減緩細胞凋亡等方面來防止卒中的進展。
腦梗死時，缺氧可導致進行性的毛細血管內皮細胞和上皮細胞的丟失以及細胞外基質和神經元的壞死，這些細胞的壞死是通過凋亡發生的。在腦卒中的發生發展中，多種潛在的遺傳危險因素可能參與其發病機制。在進展性卒中中，可能有VEGF的表達不足和經VEGF受體2的信號傳達的缺陷，源于內皮細胞受體數量的下降，或者VEGF受體/蛋白激酶活性的缺陷。影響VEGF分泌的因素有很多，VEGF936T據報道與血管內皮生長因子的低血漿水平顯著相關。缺氧可誘導內皮細胞的凋亡，加速半暗帶細胞的不可逆的壞死，而缺氧誘導的VEGF的表達的增高可延緩內皮細胞的凋亡，促進側支循環的形成，促進腦梗死的恢復，當缺氧對腦組織的損害作用與其誘導的VEGF高表達對腦組織的保護作用失衡時，將會導致進展性卒中的形成。由此我們推測，VEGF936T攜帶者由于VEGF分泌的相對不足而導致了卒中的進展。
VEGF936T等位基因者血漿低VEGF水平的確切機制至今未知。對潛在的轉錄因子結合位點的分析表明：VEGF936C有一個潛在的AP-4［1］（activator protein 4）結合位點，而936T則沒有，936位C-T突變導致了AP-4的潛在結合位點丟失。AP-4是一個螺旋環-螺旋轉錄因子。它通過結合于特殊的增強位點增強多種基因的轉錄。AP-4的潛在結合位點被VEGF936C-T突變破壞也許可以解釋該突變同VEGF的低血漿水平的相關性。另一個可能的解釋是該突變同VEGF基因序列其他部位未知突變之間的連鎖性失衡。
影響VEGF分泌的因素有很多，將來各種刺激因素所誘發的VEGF的表達，與特殊基因型之間的相互關系將引發對VEGF介導的進展性卒中的個體易感性的鑒別。對疾病相關性的研究也許會揭示發生在VEGF基因序列其他位置的未知的功能性突變同進展性卒中患者之間的關聯性。
【參考文獻】
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2 Krippl P，Langsenlehner U，Renner W，et al.A common 936C/T gene polymorphism of vascular endothelial growth factor is associated with decreaced breast cancer risk.Int J Cancer，2003，106:468-471.
3 賀維亞，黃曉哲，蔣建華.進展性卒中相關危險因素的臨床分析.中風與神經疾病雜志，2004，21（5）:461-462.
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